ГИБЕЛЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ
На первый взгляд летальное действие высокого давления на микроорганизмы сходно с действием нагревания. Однако, как мы уже неоднократно отмечали в этой главе, действие давления коренным образом отличается от действия температуры. Хотя денатурацию белков могут вызвать как высокие давления, так и нагревание или замораживание, этот процесс протекает различно в зависимости от характера воздействия. Конечно, физиологический эффект во всех трех случаях один и тот же - белок перестает функционировать. Гибель клеток под действием высокого давления так же зависит от дозы, как и их гибель при нагревании. Обычно существует пороговая величина давления, ниже которой клетки не погибают. При летальном давлении его воздействие зависит как от интенсивности, так и от продолжительности По устойчивости к высокому давлению различные микроорганизмы можно расположить примерно в таком же порядке, как и по устойчивости к нагреванию. Так, структура и организация вирусов проще, чем у клеточных микроорганизмов, и они же, как правило, оказываются более устойчивыми к летальному действию нагревания и давления. К сожалению, очень редко чувствительность вирусов и клеточных организмов к давлению сравнивали при одних и тех же условиях; относительно мало также исследований, которые позволили бы рассчитать скорости гибели Рутберг (Rutberg, 1964a, b) провел такое исследование с Е. coli и двумя фагами этого микроорганизма - Т2 и Т4. При 37°С и 2000 атм константа скорости экспоненциальной гибели составляла около 0,125 мин-1 для бактерий и лишь соответственно 0,045 и 0,033 мин-1 для двух фагов Колифаг Т5 по oсвоей чувствительности занимает промежуточное положение между фагами Т2 и Т4. Позднее Соломон и др. (Solomon et al., 1966) установили, что скорость гибели фага Т4 при 25°С была менее 0,1 мин-1 при давлениях ниже ~3400 атм, но она экспоненциально возрастала при более высоких давлениях. Инактивация подчинялась кинетике первого порядка при всех испытанных давлениях, а оптимальная температура инактивации равнялась примерно 25°С в изученной области от 0 до 50°С. Как показали фотографии, сделанные в электронном микроскопе, большинство убитых вирусов в суспензиях, подвергнутых действию высокого давления, имели сокращенные чехлы отростков, а у многих из них головки были лишены содержимого. Аналогичные изменения происходят под действием мочевины или в результате инкубации вируса со стенками клетки-хозяина.
Давление способно также нарушить равновесие между лизо-генной клеткой-хозяином и профагом. Если клетки Е. coli инкубировали под давлением 2000 атм при 37°С в течение 5 мин, то они освобождали вирулентные фаговые частицы (Rutberg, He-den, 1960); эти частицы, как видно на электронных микрофотографиях, в морфологическом отношении сходны с колифагом Т5 и, возможно, PI (Edebo, Rutberg, 1960). В дальнейших исследованиях было показан*), что давление 290 атм индуцирует освобождение фага Я лизогенной культурой Е. coli К (Rutberg, 1964с).
Как и следовало ожидать, фаги отличаются относительно широким спектром чувствительности к давлению. Раутенштейн и Мурадов (1966) обнаружили, что четыре фага, выделенные из полилизогенного штамма Actinomyces tevoris, отличаются очень высокой барочувствительностью и инактивируются уже при давлении около 500 атм и температуре 28°С за 30 мин. Фаги из другого актиномицета, Л. olivaceus^ были более устойчивыми - давление в 700 атм почти не действовало на них в течение 30 мин. Давление всего в 200 атм индуцирует освобождение вышеупомянутых четырех фагов спорами A. levoris, в то время как даже для минимальной индукции освобождения фагов спорами Л. oliva-ceus требуются более высокие давления: от 500 до 700 атм. Инкубация спор обоих организмов при 700 атм в течение 30 мин не приводит к их гибели.
Давление может также инактивировать вирусы животных и растений. Было найдено, что стафилококковые фаги инактивируются в течение 45 мин при давлении от 2000 до 3000 атм, вирус герпеса -ври давлении 3000 атм, вирусы осповакцины, бешенства, ящура и куриной оспы - при давлении 4000-5000 атм, а вирус энцефаломиелита лошадей - при давлении 7000 атм (Basset et al., 193
. Наиболее подробно была изучена инактивация под действием давления вируса табачной мозаики (Basset et al., 1938; Lauffer, Dow, 1941). Этот процесс носит по-видимому, кооперативный характер, поскольку давления от 5000 до 6000 атм не оказывали никакого действия, в то время как давления от 7500 до 9000 атм уже через несколько минут приводили к инактивации вируса, причем изменение объема было весьма значительным. Во время инактивации происходила коагуляция вирусного белка и освобождение вирусной нуклеиновой кислоты. Оказалось, однако, что сначала имеет место инактивация, а потом уже коагуляция, которая представляет собой, по-видимому, вторичный процесс, следующий за дезинтеграцией вируса (Lauffer, Dow, 1941).
Относительная устойчивость вирусов к давлению наводит на мысль, что эти организмы способны выживать в течение очень длительных периодов времени в глубине океана, где процессы, прийодящие в обычных условиях к их деструкции, протекают медленнее. Не исключено, что работа с пробами глубоководных осадков требует особых предосторожностей.
Гибель вегетативных бактериальных клеток под действием давления примечательна в том отношении, что она происходит при сравнительно низких давлениях; кроме того, мы вообще мало знаем об основных механизмах этого процесса. Как правило, давления, лишь ненамного превышающие значение максимального для роста давления, летальны для бактерий. Клетки погибают не просто потому, что перестают расти, а потому, что эти давления убивают их непосредственно. Мы обнаружили, например, что клетки Arthrobacter crystallopoietes быстро погибают в деионизованной воде, морской воде или разбавленном фосфатном буфере под действием давления всего лишь в 1000 атм, хотя в покоящемся состоянии эти организмы могут пребывать при 1 атм несколько недель. Типичные константы скорости экспоненциальной гибели варьировали от -^0,185 ч"1 в деионизованной воде при 35°С до ~ 0,055 ч^1 в 10 мМ растворе NaCl при 4°С. Гибель клеток A. crystallopoietes под действием повышенного давления была меньше при 4°С, чем при комнатной температуре. Таким образом, взаимодействие температуры и давления в данном случае отличается от закономерностей, которые наблюдаются для роста. Мы установили, что охлаждение защищает и другие бактерии от гибели под действием давления. Напротив, гибель клеток Е. coli и Serratia marinorubra, вызванная давлением 1000 атм, происходила быстрее при 4°С, чем при 8,5; 15 или 25°С (Kim, ZoBell, 1971). Мы обнаружили также, что соли защищают клетки от гибели, однако их действие связано скорее с изменениями ионной силы, а не со специфическим эффектом ионов. Морита и Бекер (Morita, Becker, 1970) также отмечают защитное действие солей. Как давление, так и соли влияют на электростатические взаимодействия в биополимерах, и не трудно предствить себе, каким образом они могут оказывать противоположное действие.
Даже такие относительно низкие давления, как 200 атм, могут быть летальными для многих бактерий (ZoBell, Johnson, 1949; Oppenheimer, ZoBell, 1952). Мы не располагаем многочисленными данными определения скоростей гибели клеток; тем не менее, как видно из предыдущего абзаца, эти величины сильно зависят от экспериментальных условий. Как правило, споры устойчивее к давлению, чем вегетативные клетки, за одним довольно интересным исключением. При относительно низких давлениях бактериальные споры способны прорастать (Clouston, Wills, 1969, 1970; Gould, Sale, 1970, 1972; Sale et al., 1970); возникающие в результате проросшие формы гораздо чувствительнее к давлению, чем споры - почти в такой же степени, как и вегетативные бактерии. Например, споры Bacillus pumilus погибают уже при 610 атм - это давление вызывает прорастание (Clouston, Wills, 1969); в то же время споры многих видов Bacillus выдерживают давления свыше 12 000 атм, которые подавляют прорастание (Larson et al., 1918; Basset, Macheboeuf, 1932). Следовательно, сравнительно низкие давления могут оказаться летальными для спор, а более высокие давления - нет. Сейл и др. (Sale et al., 1970) обнаружили, что прорастание и гибель спор Bacillus coagulans под действием давления проявляются сильнее при высоких температурах, а не при низких, и что NaCl или СаС1г оказывают защитный эффект.
Клетки эукариот также погибают при высоком давлении; кроме того, в среднем они гораздо чувствительнее к давлению по сравнению с клетками прокариот. При повышении давления скорее погибали клетки Saccharomyces cerevisiae, чем клетки Serratia marcescens (Hite et al., 1914). Эти два организма погибали при действии в течение часа давлений соответственно 2040 и 2720 атм. Хил и Морита (Hill, Morita, 1964) установили, что давления от 600 до 1000 атм убивали при 27°С мицелий и зооспоры пресноводной плесени Allomyces macrogynus; эти авторы высказали предположение, что одна из причин гибели клеток заключается в обнаруженном ими ингибировании дыхания митохондрий под действием давления. Еще более чувствительны к действию давления Amoeba proteus и Amoeba dubia, так как они погибали через 1 ч при 450 атм (Marsland, Brown, 1936).
Следует отметить, что мы до сих пор очень мало знаем о механизмах гибели микроорганизмов под действием давления. Повреждения, наносимые им, имеют скрытый характер, так как их почти не удается обнаружить в фазово-контрастном микроскопе у клеток бактерий или грибов, убитых давлением. Кроме того, гидростатическое давление можно рассматривать как потенциальный дезинфицирующий агент, особенно в свете того, что нередко бактерии и грибы погибают при давлениях, которые не денатурируют многие лабильные биополимеры. Так, молоко можно стерилизовать под давлением около 6800 атм при комнатной температуре в течение семи дней, и при этом ферменты в молоке не утрачивают своей активности (Hite et al., 1914). Хаит и др. (Hite et al., 1914) также установили, что груши, персики, виноградный и яблочный сок стерилизуются даже при более низких давлениях, хотя овощи и ягоды после обработки давлением портятся. Сравнительно недавно Тимсон и Шорт (Timson, Short, 1965) сделали попытку стерилизовать молоко при помощи давления, однако Bacillus, Micrococcus и некоторые другие организмы не удалось устранить полностью даже под давлением около 10 000 атм. Тем не менее обработка давлением, так же как пастеризация, помогает уменьшить количество бактерий в молоке. При инкубации проб сточной воды под давлением от 500 до 1000 атм при 4°С выживали в основном виды Arthrobacter и Corynebacteriurn (Baross et al., 1975).